Nach Beendigung der Lehre war Eduard Weber von 1849 bis 1851 zunächst bei verschiedenen Firmen in England beschäftigt. 1852 ging er in die chilenische Hafenstadt Valparaiso, wo er 1856 die Im- und Exportfirma Weber, Münchmeyer & Co. gründete, die ab 1861 unter Weber & Cia. firmierte und sich zu einer der größten Firmen der südamerikanischen Westküste entwickelte. 1862 kehrte er in seine Geburtsstadt Hamburg zurück und errichtete das auf Salpeter spezialisierte Handelshaus Ed. F. Weber. 1877 wurde er Konsul für die Hawaii-Inseln (bis 1902) sowie Vorsteher und Jahresverwalter der Niederländischen Armenkasse. Weber, Besitzer mehrerer schlesischer Güter, nannte eine bedeutende, der Öffentlichkeit zugängliche Gemäldegalerie sein Eigen und war einer der größten deutschen Kunstsammler seiner Zeit. Ihm gehörten insgesamt 360 Bilder, darunter Werke von Peter Paul Rubens, Rembrandt, Andrea Mantegna, Hans Holbein d. Ä., Albrecht Dürer und Lucas Cranach d. Ä. Ein Teil dieser Sammlung ging nach Webers Tod an die Hamburger Kunsthalle. In seinem Testament hatte er die komplette Gemäldegalerie der Stadt Hamburg für 2,5 Millionen Mark angeboten, diese lehnte jedoch ab. 1912 wurde der Rest der Sammlung in Berlin für insgesamt 4,5 Millionen Mark versteigert.